OSN-SAbstraktaSCSOSN-E

Stanovení tricyklických antidepresín  v séru soupravou Emit® toxTM Serum Trycyclic Assay Dade Beohring na analyzátoru Cobas Interga 400 plus.

 

OSN-SSeznam souvisejících dokumentů a textůOSN-E

 

OSN-SKódy a názvy v různých klasifikačních systémechOSN-E

Tricyklická antidepresiva , TCA LIRS 313, VZP 91149

 

OSN-SPrincip

Emit® tox™ Serum Tricyclic Antidepressants Assay je homogenní enzymatická imunochemická

metoda sloužící k analýze specifických sloučenin v biologických tekutinách. Test je založen na

kompetici mezi drogou ve vzorku a drogou značenou enzymem glukosoa6afosfátdehydrogenázou

(G6PDH) o vazebná místa na protilátce. Aktivita enzymu klesá při vazbě na protilátku, proto lze

koncentraci drogy ve vzorku měřit podle změny aktivity enzymu. Aktivní enzym mění

nikotinamidadenindinukleotid (NAD) na NADH, což se projeví změnou absorbance,která se měří spektrofotometricky. Endogenní sérová G6PDH při tom neinterferuje,protože koenzym NAD

působí pouze s bakteriálním enzymem (Leuconostoc mesenteroides) použitým v tomto testu.OSN-E

 

 

OSN-SDefinice a terminologieOSN-E

Kazeta COBAS®INTEGRA DEV 02 se připraví podle postupu, který je popsán v oddílu REAGENCIE.

Souprava je umístěna v lednici, místnost  biochemie. Souprava obsahuje 200 testů.

Princip odpovídá metodě doporučené SKB ČLS JEP a IFCC.

 

 

 

OSN-SMísto provádění postupuOSN-E

Oddělení klinické biochemie Psychiatrické léčebny v Opavě, Olomoucká 88, 746 01 Opava

 

OSN-SBezpečnostní aspektyOSN-E

Je nutné dodržovat obecné zásady bezpečnosti práce podle ČSN 01 8003, ale i zásady práce s biologickým materiálem, který může být zdrojem přenosu některých infekcí. Zejména je třeba zachovávat pravidla osobní hygieny, používat osobní ochranné pracovní prostředky (oděv, obuv a podobně), při práci nejíst, nepít a nekouřit. Po práci a před jídlem omýt pokožku především rukou teplou vodou a mýdlem a ošetřit vhodným reparačním krémem (viz zásady bezpečnosti práce). Při zasažení očí vymývat velkým množstvím vlažné vody nejméně 15 minut. Při zasažení oděvu a kůže odložit veškeré kontaminované oblečení. Okamžitě kůži omýt velkým množstvím pokud možno vlažné vody popř. mýdlem nebo jiným vhodným mycím prostředkem. Po umytí ošetřit vhodným reparačním krémem. Při náhodném požití vypláchnout ústa, dát vypít asi 1/2 litru vody a vyhledat lékařskou pomoc.

 

OSN-STeorie, použití, preanalytické požadavkyOSN-E

Tricyklická antidepresiva jsou nejstarším typem léku na depresi. Zabraňují zpětnému vychytávání neurotransmiterů (serotoninu, noradrenalinu a dalších). V současnosti se nasazují až po selhání novějších selektivních inhibitorů (SSRI, SNRI), zejména v těžkých případech deprese. Mezi nežádoucí účinky patří zvýšená srdeční frekvence, ospalost, sucho v ústech, zácpa, retence moči, poruchy vidění, závratě, zmatenost, sexuální dysfunkce. Toxicita se objevuje na přibližně desetinásobku běžné dávky, při předávkování nastává totální arytmie. Nicméně, tricyklických antidepresiva jsou stále používána, díky jejich účinnosti, a to zejména v závažných případech deprese.


Patří mezi ně:

 

Tricyklická antidepresiva blokují neuronální absorpci neurotransmiterů. Mechanismus účinku není kompletně zcela znám, ale předpokládáme jejich úlohu ve změně presynaptické a postsynaptické odpovědi neurogenních aminových receptorů. Antimuskarinový efekt tricyklických antidepresiv je odpovědný za vedlejší účinky pozorované u terapeutických koncentrací léčiv i u toxických projevů. Tento efekt zahrnuje tachykardii, snížení gastrointestinální motility, sucho v ústech, hyperpyrexii, rozšíření zornic a retence moče, přičemž efekt je silně závislý na dávce antidepresiv. Manifestace CNS při intoxikaci antidepresivy se může měnit od mírných projevů, vzrušení a třes, až po delirium a kóma. Kardiovaskulární toxicita těchto léčiv je jednou z hlavních příčin úmrtí při intoxikacích. Jedná se o život ohrožující stavy vyžadující sledování vitálních funkcí a intenzivní terapii. Tricyklická antidepresiva inhibují vstup Na+ v sodíkových kanálech myokardu, čímž dochází ke snížení vodivosti a kontraktility. Výsledkem je arytmie, jejich anticholinergní a sympatomimetický účinek (inhibice vychytávání katecholaminů) také přispívá k dysrytmii. V časném stadiu intoxikace tricyklickými antidepresivy lze tedy pozorovat přechodnou hypertenzi, která souvisí se zvýšenou koncentrací biogenních aminů. V pozdějším stadiu se srdeční výkon snižuje, kombinovaný s α-adrenergní blokádou dochází k hypotenzi. Při závažných intoxikacích smrt často nastává následkem arytmie nebo hypotenze. Kardiotoxická manifestace se obvykle projeví do 24 hodin od požití, není výjimkou pozorovat projevy toxicity již hodinu od požití. Léčba intoxikací antidepresivy je převážně symptomatická.

 

 

 

Analytická proveditelnost :

-     Hranice ředění – semikvantitativně 4000ng/ml

-     Časová dostupnost výsledku - výsledky jsou k dispozici 3 hodiny od přijetí materiálu, statimové vyšetření  do 1 hodiny.

-     Ekonomické náklady -jedno stanovení = 35,57,- Kč

-     Po zavedení metody do rutinního provozu provádí stanovení středoškolsky vzdělaný laborant.

-     Požadavky na spolehlivost měřícího systému.

 

OSN-SZnaky analytické metodyOSN-E

Mez stanovitelnosti                   semikvantitativně 4000ng/ml

Mez detekce                            75 ng/ml jako sekobarbital

Analytická citlivost                     cutoff 300 ng/ml 

Diskriminační mez                   

Specifita                                  dáno specifitou použitého antiséra.

Analytická nepřesnost                          

Limitace-interference

 

                                                                           

                                                          

 

 

Data uvedená v této části byla získána na Syva® ETS® Plus Analyzer .

 

Výsledky je Emit ® tox™ Serum Tricyclic Antidepressant Assay jsou ovlivněny všemi parametry

měření. Následující informace zahrnují celý systém měření a neměly by být interpretovány pouze

ve vztahu k reagenciím.

 

Citlivost

Citlivost Emit ® tox™ Serum Tricyclic Antidepressant Assay je 75 ng/ml pro sérum a plazmu.

Citlivost je definovaná jako nejnižší koncentrace nortriptylinu, která může být odlišena od 0 ng/ml

na hladině pravděpodobnosti 95 %.

 

Přesnost

Tabulka 2 — Přesnost při jedné sérii měření


 


                                                                   Průměr                  Směrodatná               Variační

                                         Studie   N          ( ∆A)                  odchylka (∆A)             koeficient (%)


 


Negativní kontrola                1       16           635                          4,8                             0,8

(0 ng/ml nortriptylinu)           2       16           608                          3,2                             0,5

 

Kalibrátor                             1        16           730                           5,3                            0,7

(300 ng/ml nortriptylinu)       2        16           705                           5,0                            0,7

 

Pozitivní kontrola                  1       16            804                          5,9                            0,7

(1000 ng/ml nortriptylinu)     2        16           785                           8,3                           1,1


 

 


Specificita

 

Emit® tox™ Serum Tricyclic Antidepressant Assay zachycuje specifická  tricyklická

antidepresiva  v  séru  či  plazmě.  Vysoké  terapeutické  koncentrace,  200–300 ng/ml

a  toxické hladiny  chlorpromazinu mohou  též  způsobit pozitivní výsledek  testu. Cyklobenzaprin  v  terapeutické  koncentraci  tj.  20–34  ng/ml by  neměl  dát  pozitivní  výsledek,  ale  jeho  vysoké  koncentrace  > 200  ng/ml  by ho mohly  způsobit. Test  zachycuje  též  thioridazin  v  terapeutické  koncentraci  (> 1,5 µg/ml), difenhydramin v  toxické koncentraci (> 12 µg/ml), orfenadrin citrát

při  smrtelné  koncentraci  (> 6 µg/ml)  a  cyproheptadin  v  terapeutické  koncentraci

(> 0,42 µg/ml).

Odezva  testu na  čtyři  základní  sloučeniny  je  lehce odlišná. (viz  tab. 3) V  tabulce 3  je uveden přehled  koncentrací  jednotlivých  sloučenin, při kterých vykazují pozitivní výsledky.

 

OSN-SOdběr materiáluOSN-E

Sérum

Odběr, příprava a uchování  vzorků

Sérum, plazma. Je doporučeno uchovávat odebrané vzorky při 2 - 8°C a analýzu provést do 3 dnů od odběru. Pro dlouhodobé uchování je třeba vzorky zmrazit.

 

OSN-SManipulace s materiálemOSN-E

Podle běžných zásad práce s biologickým infekčním materiálem.

 

OSN-SPřístroje a pomůckyOSN-E

Cobas Integra 400 plus

 

OSN-SReagencieOSN-E

 

Souprava obsahuje:

·         činidla R1

·         činidla R2

 

Emit® tox™Serum Tricyclic Antidepressants Assay Antibody/Substrate Reagent A              3 ml

 

Ovčí protilátka reagující s desipraminem (74 µg/ml), glukosoa6afosfát (66 mM),

nikotinamidadenindinukleotid (40 mM),Tris pufr , látka zvětšující objem, stabilizátory

a konzervační prostředky

 

Enzyme Reagent B                                                                                                                 3 ml

 

desipramin značený bakteriální glukosoa6afosfátdehydrogenázou (0,47 U/ml),

glukosoa6afosfát (32 mM), Tris pufr , látka zvětšující objem, stabilizátory a konzervační

prostředky

 

Emit® Drug Assay Buffer Concentrate                                                                                       13,3 ml

 

Tris pufr , surfaktant a konzervační prostředky

 

 

Počet testů v kazetě

200

 

Pozice A  (lahvička COBAS INTEGRA 22,9 ml).

 

1.   Rozpusťte obsah reagencie A (protilátka/substrát) ve 3 ml destilované vody a to podle

      instrukcí na štítku a vloženého letáku.

2.   Smíchejte  Emit Drug Assay Buffer Concentrate 1:10 (1+9) s destilovanou vodou.

3.   Smíchejte 3 ml rekonstituované reagencie A a 24 ml roztoku ředěného pufru.

4.   Do větší lahvičky COBAS INTEGRA přeneste 23 ml tohoto roztoku.

5.   Lahvičku pevně uzavřete víčkem.

6.   Tuto lahvičku umístěte do kazety na pozici A (tato pozice je označena na dně kazety ).

 

Pozice B ( nechejte ji prázdnou)

 

Pozice C (lahvička COBAS INTERGA  11,0 ml).

 

7.   Rozpusťte obsah reagencie B (enzymová reagencie) ve 3 ml destilované vody a to podle

      instrukcí na štítku a vloženého letáku.

8.   Smíchejte 3 ml reagencie B a 6ml zředěného roztoku pufru.

9.   Přeneste 11 ml tohoto roztoku do malé lahvičky.

10. Lahvičku pevně uzavřete víčkem.

11.Tuto lahvičku umístěte do kazety na pozici C (tato pozice je označena na dně kazety ).

12. Kazetu uzavřete víčkem kazety.

 

Jestliže použijete novou kazetu nalepte právně na ni štítek s čárovým kódem podle instrukcí

na str. 5.

 

Nyní je nová kazeta TRIC připravena. Více informací o kazetách naleznete v Uživatelské příručce

COBAS INTEGRA 400 plus.

 

Poznámka:

U analyzátoru COBAS INTERGA 400 plus pokaždé, když vložíte kazetu Utility Channel budete vyzváni,

aby jste označili, zda jste kazetu znovu naplnili. Na odpovídající tlačítko klikněte pouze, pokud jste tuto kazetu naplnil (viz obr. 1).

COBAS INTERGA není schopna rozlišit mezi dvěma různými kazetami stejné aplikace.

Abychom se vyhnuli chybným výsledkům doporučujeme používat pouze jednu oštítkovanou

kazetu Utility Channel.

Příprava kazety.

Nalepení štítku na kazetu.

 

Chcete-li použít novou kazetu, nalepte na ní štítek s čárovým kódem TRIC a to podle instrukcí,

které jsou uvedeny níže. Prázdnou kazetu se štítkem s čárovým kódem nevyzujte do odpadu.

 

     Štítek s čárový, kódem
 

Pozice štítku s čárovým kódem

na opační straně kazety
 
                                                                                                                           

 

Umístění lahviček COBAS INTEGRA.

 

Lahvičky umístěte na odpovídající místa. Pozice lahvičky je označena na dně kazety.

Používejte pouze nové lahvičky a nové zátky.

 

 

          Kryt kazety
 

          Pozice lahviček
 
                                                           .

Uzavření kazety.

Zacvakněte kryt do kazety. Kryt znovu nepoužívejte.

 

Poznámka:

Používejte pouze doplňky uvedené na straně 2. Používejte vždy nové lahvičky COBAS INTEGRA, víčka a kryty kazet a vždy čerstvě připravené reagencie. Doplňky  určené pro jedno použití nikdy nepoužívejte znovu, protože může dojít ke kontaminaci reagencií a tím i k chybným výsledkům.

 

 

V neotevřeném stavu při 2 - 8 °C jsou roztoky stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu. Roztoky jsou připraveny k použití. Po instalaci do přístroje jsou stabilní 8  týdnů.

 

 

OSN-SSpotřební materiálOSN-E

Kalíšky typu Eppendorf

 

Příslušenství (objednávka u fy. Roche).       

 

Kat.č.                          Obsah        Množsství              Poznámka

 

3149099                       Kazeta             2                     vícenásobné použití

Utility chanel kit II          Kryt kazety       25                   na jedno použití

                                   Lahvička 22,6 ml 25                  na jedno použití

                                   Lahvička 11,0 ml 50                    na jedno použití

                                   Víčko lahviček   75                    na jedno použití

 

 

Poznámka: Dodávku štítků s čárovými kódy zajišťuje fa Roche.

 

 

 

 

OSN-SKalibraceOSN-E

 

Kalibrační křivka je vystvožena s použitím  kalibrátoru Emit®  toxTM  Serum Tricyclic Antidepressant Assay Calibrator/Control firmy Dade Begring kat.č. 7C219 UL. Kalibrátory je třeba umístit na kalibrační stojánek od nejvyššího po nejnižší. Jejich analýzu je nutno provést do dvou hodin po umístění na palubu přístroje. Kalibrační křivka je uchována v paměti přístroje COBAS INTEGRA 400 a lze ji při pozdějším použití vyvolat. Křivka je stabilní  do 12 týdnů. Novou křivku je nutné vytvořit s každou novou šarží reagencií.

Stabilita

Kalibrátory jsou stabilní do data uvedeného na obalu. Kalibrátor byl připraven z krve dárců testovaných individuálně na přítomnost HBsAG, HCV a HIV protilátek. Je nutné s ním zacházet podle pravidel o bezpečnosti práce s biologickým materiálem.

Vlastní kalibrace

Kalibrační faktor se vypočítává pomocí softwaru analyzátoru. Způsob kalibrace je lineární interpolace nebo lineární regrese. Kalibrace se provádí na základě výsledků kontroly správnosti. Kalibrační data jsou automaticky archivována v softwaru analyzátoru, v tištěné podobě jsou ukládána do desek "Kalibrace metod".

 

OSN-SPracovní postupOSN-E

 

Kazetu Cobas Integra DEV 02  umístíme do prostoru pro reagencie. Připravíme kontrolní materiály (fy ROCHE). Umístíme je do příslušného stojanu (č.6) do před definovaných pozic a po ukončení měření program vyhodnotí výsledky a určený pracovník, který rozhodne zda odpovídající analýza může probíhat. Způsob měření absorbance. Stanovení je kinetické s měřením mezi 36 a 41 bodem, při  primární vlnové délce  340 a emise 409 nm.Při koncentraci vyšší než měřící rozsah je výsledek označen kódem pro opakovaní měření z naředěného vzorku.Pipetuje se 2 µl .

 

 

 

OSN-SDokumentace, zpracování a hodnocení dat

OSN-E

Celková koncentrace se zjistí výpočtem podle optimální kalibrační křivky  lineární interpolace nebo lineární regrese pomocí softwaru analyzátoru (viz příloha).

 

OSN-SZpůsob vydávání výsledkůOSN-E

 

Hodnoty se udávají na jedno desetinné místo, v ng/ml, po kontrole odesílají na oddělení. Výsledky se vydávají v papírové formě, statimové výsledky rovněž, ale je možno i telefonicky na lince 191.

 

OSN-SŘízení kvalityOSN-E

 

Jako kontrolní materiál se používají standardy přiložené ke kalibrátoru.  Používají se stejným způsobem jako vzorek, expirace je udána na každém balení. Do měření se zařazují při každém měření. Kontroly správnosti vyhodnocuje provozní chemik, který v případě nevyhovující kvality podniká určitá opatření: výměnu reagencií, novou kalibraci a následnou kontrolu správnosti metody, kontrolu dávkovacího a fotometrického zařízení analyzátoru atd. Výsledky kontrol jsou průběžně ukládány do paměti analyzátoru, jsou vytištěny ". Externí kontrola kvality v rámci České republiky je organizována SEKK a naše laboratoř se jí účastní 2x až 4x do roka.

 

 

OSN-SKlinické údajeOSN-E

Pokud je Emit® tox™ Serum Tricyclic Antidepressant Assay použit jako kvalitativní, nelze určit množství drog v žádném z analyzovaných vzorků. Výsledek testu odliší pouze pozitivní vzorky od negativních—pozitivní nález indikuje vzorky obsahující tricyklická antidepresiva.

 

OSN-SPoznámkyOSN-E

 

OSN-SJiné související informaceOSN-E

Omezení postupu

Informace o látkách testovaných na zkříženou reaktivitu viz. odstavec specificita. Existuje také možnost, že mohou interferovat i jiné komponenty nebo faktory, které mohou negativně ovlivnit výsledek (technická chyba, nebo chyba postupu). Chybný výsledek může způsobit i znehodnocení vzorku. Při podezření na znehodnocený vzorek je třeba odebrat nový. K získání dalších informací o možných příměsích znehodnocujících provedení testu, kontaktujte lokálního zástupce Roche.

Pozitivní výsledek stanovený tímto testem indikuje přítomnost metabolitu barbiturátu nebo jeho metabolitů v moči, nestanovuje však míru intoxikace.

 

OSN-SLiteraturaOSN-E

Pracovní návod soupravy Emit tox TCA firmy Dade Behring.

Masopust, J.: Požadování a hodnocení biochemických vyšetření

Dzúrik, R. a kol.: Štandardná klinickobiochemická diagnostika

Hořejší, J. a kol.: Základy klinické biochemie ve vnitřním lékařství

 

OSN-SAppendixyOSN-E

 

 

OSN-SStručný popis postupuOSN-E

 

Obsluha provede kontrolu reagencií, kalibraci metod a následnou kontrolu metod (kontrolu provádí vysokoškolský určený pracovník). Analyzovaný materiál  se umístí do určených stojánků buď pomocí čárových kódů přímo vytištěných pro daný materiál nebo při plánovacím způsobu do předem připravených zkumavek označených čárovým kódem. Požadavky analýz se předají do Cobas Integra on-line z počítače a po provedení analýzy se převedou elektronicky zpět.Tyto výsledky jsou uchovávány v systému LIRS.

 

 

OSN-SAutorské poznámkyOSN-E

 

 

OSN-SDoporučení, recenze, schváleníOSN-E

Autor a spoluautoři: RNDr František Hiemer

Recenze: pracovníci firmy ROCHE

Vyjádření:

Revize: